This study compared organic matter removal and methane production performance of AD and BEAD reactors by gradually increasing food waste OLR. Bacterial communities in reactor bulk solution were measured at each OLR to investigate the effect of voltage supply to bacterial species change in bulk solution. The BEAD reactor maintained stable levels of COD removal and methane production at 6.0 kg/m3・day. Conversely, the AD reactor’s maximum OLR for optimal operation was only 4.0 kg/m3・day. pH and alkalinity decline and VFA accumulation, which are the problem in high load anaerobic digestion of readily decomposable food wastes, were again the major factors destroying the optimal operation condition of the AD reactor at 6.0 kg/m3・day. Contrarily, the electrochemically activated dense communities of exoelectrogenic bacteria and VFA-oxidizing bacteria prevented VFAs from accumulating inside the BEAD reactor. This maintained pH and alkalinity at appropriate levels, ultimately contributing to stable methane production.
신원범 사원, 환경사업부(jhkim1@samaneng.com)
1. 서론
화석연료를 대체하기 위한 바이오에너지의 수요가 지속적으로 증가함에 따라 유기성폐기물로부터 바이오가스(메탄)를 생산할 수 있는 혐기성소화(AD, Anaerobic digestion) 연구의 중요성이 높아지고 있다[Haralambopoulos and Polatidis., 2003; Butti et al., 2016; Lee et al., 2017]. 일반적인 혐기성소화 반응은 가수분해, 산생성, 메탄생성 단계로 구분되며, 메탄생성단계에서의 안정화는 혐기성소화의 성패를 좌우하는 중요한 인자이다[Chakraborty and Mohan, 2018]. 특히, 음식물류폐기물과 같은 고농도 유기성폐기물은 산성(pH 5.0이하)을 띄고, 주로 쉽게 분해가 가능한 탄수화물로 이루어져 있기 때문에 반응조에 과부하가 걸리기 쉽다[Capson-Tojo et al., 2018]. 이러한 이유로 음식물류폐기물을 높은 유기물부하(OLR, Organic loading rate)에서 운전하는 경우, AD 반응조 내 가수분해 및 산생성 미생물과 메탄생성 미생물간의 불균형 정도가 증가하여 휘발성지방산(VFAs, volatile fatty acids)의 축적과 pH 및 alkalinity의 저하가 빈번하게 발생되고, 이는 메탄생성단계의 저해인자로 작용한다[Themelis and priscilla, 2007; Zinder et al., 1984; Asztalos et al., 2015].
최근, 미량의 전압을 AD 반응조 내에 설치된 전극으로 공급하여 AD의 효율을 향상시킬 수 있는 BEAD(Bio- electrochemical AD)기술은 그 관심도가 지속적으로 상승하면서 매우 다양하게 연구되고 있다[Liu and Logan., 2004; Logan et al., 2008; Song et al., 2016]. 특히, BEAD는 높은 OLR에서 VFAs의 축적, pH 및 alkalinity의 저하, 낮은 미생물 활성도 등의 AD 문제점을 bio-electrochemical 반응을 통하여 해결할 수 있으며, 더불어 후속되는 메탄생성단계의 빠른 안정화에 기인한다고 보고되고 있다[Ahring et al., 1995; Liu et al., 2016; Park et al., 2018]. Feng et al.(2018)은 미량의 전압이 BEAD 반응조 bulk solution 내 전기활성미생물(EAM, electro-active microorganisms)의 활성을 향상시킨다고 보고하였으며, Park et al.(2018)은 BEAD가 bulk solution 내 미생물의 종 변화를 유도하고, bio-electrochemical reactions를 통하여 축적된 VFAs를 빠르게 분해시킴으로서 안정화 및 메탄발생 속도를 향상시킬 수 있다고 보고하였다. 또한, Feng et al.(2017)은 up-flow anaerobic bio-electrochemical reactor의 bio-film보다 bulk sludge 내의 전기활성미생물의 군집구조가 더 풍부해졌고, 그로 인해 bulk solution의 전자전달 효율이 개선되어 유기물 분해효율 및 메탄 발생량이 증가한다는 연구결과를 보고하였다. 즉, 공급된 미량의 전압은 BEAD 반응조 내 미생물의 종 변화 및 활성도 향상을 유도하고, 전기화학적으로 적응된 특정 EAM에 의하여 VFAs의 빠른 분해와 메탄발생 속도의 향상이 가능하다는 것이다[Lee et al., 2017; Park et al., 2018]. 흥미로운 사실은 기존에 중점적으로 연구되었던 전극 표면에서의 microorganism과 더불어 전압의 공급이 BEAD bulk solution에서의 종 변화에도 큰 기여를 한다는 것이다. 이러한 bulk solution 내의 전기화학적 종 변화는 실용화에 접근하고 있는 BEAD 기술에서 전극면적의 최소화를 가능하게 할 수 있으며, 이는 효율적 및 경제적 측면의 중요한 정보를 제공할 수 있다. 이들의 연구결과를 종합해보면, 전압의 공급은 BEAD bulk solution 내의 미생물 종 변화를 유도할 수 있고, 이는 음식물류폐기물의 높은 OLR에서 나타나는 VFAs 축적 및 pH 저하 등의 저해인자를 해소하면서 안정적인 메탄발생 가능하다는 것을 암시한다.
따라서, 본 연구에서는 AD와 BEAD 반응조에서 음식물류폐기물의 OLR을 단계적으로 증가시킴으로서, OLR 증가에 따른 bulk solution 내 박테리아 군집을 분석하여 전압의 공급이 bulk solution 내 박테리아 종 변화에 미치는 영향을 연구하였다.
2. 실험방법 및 재료
2.1 반응조와 전극의 구성
반응조는 AD와 BEAD의 효율을 비교하기 총 부피는 25L (직경 280mm, 높이 410mm), 유효부피 20L의 원통형 아크릴 재질로 제작되었다. 반응조 내 완전혼합을 위한 교반기(Agitation speed, 100rpm)를 설치하였으며, 반응조 상단에 바이오가스 유출 밸브를 설치하여 50 L 포집백 (Tedlar gas bag)에 포집하였다. 반응조 측면 상단과 하단에는 각 각 슬러지의 유입과 유출을 위한 밸브를 설치하였으며, sequencing batch reactor (SBR)로 운전하였다. 그리고 BEAD 반응조에는 전기화학반응을 위한 총 6세트의 전극이 설치되었으며, 전극 한 세트(W150 × H300 mm, Area : 0.045m2)에는 전극 간에 빠른 물질전달을 위해 산화전극과 환원전극을 최소간격(1mm)으로 구성하였으며, 산화전극과 환원전극의 접촉으로 인한 단락을 예방하기 위해 부직포(1mm)를 설치하여 샌드위치 형태로 구성했다. 그리고 각 각 전극의 재질은 graphite carbon을 기초로 하여 전극 표면에 Ni, Cu and Fe 등을 도포했으며 전기전도도와 전류밀도 등과 같은 전기화학적 반응의 활성을 향상시켰다. 이들 전극에는 DC Power Supply를 이용해 0.3V의 전압이 공급하였다.
Fig 2-1. Detailed configuration of AD(a) and BEAD (b) reactors.
2.2 운전조건
각 반응조의 운전은 Table 1과 같이 OLR을 2(R1, 0 - 364 d), 4(R2, 365 - 598 d), 6(R3, 599 - 657 d) kg-COD/m3・day로 단계적으로 증가시켰으며, 약 37-40℃로 온도가 고정된 항온실에서 HRT (hydraulic retention time) 20일로 운전하였다. 식종슬러지는 C시 음식물류폐기물 자원화 시설 내 중온 혐기성소화조에서 채취하였고, 주입된 기질 역시 동 시설로 유입되는 음식물류폐기물을 사용하였다. 기질은 OLR을 기준으로 1일 1회 주입 및 배출되는 SBR (sequencing batch reactor)로 수행하였다.
Table 2-1. Operational conditions of AD and BEAD reactors
2.3 박테리아 분석
2.2.1 Sludge sampling and DNA extraction
Bulk sludge는 R3가 끝날 때 AD 및 BEAD 반응기에서 샘플링되었습니다. DNA는 제조업체의 지침에 따라 토양 용 FastDNA SPIN 키트 (MP Biomedical, LLC, Santa Ana, CA, USA)를 사용하여 추출되었습니다.
2.2.2 PCR amplification and Illumina sequencing
PCR 증폭은 16S rRNA 유전자의 V3에서 V4 영역을 대상으로 하는 primers를 사용하여 추출된 DNA로 수행하였다. 박테리아의 추출 위해 341F (5-TCGTCGGCAGCGTC -AGATGTGTATAAGAGACAG-CCTACGGGNGGCWGCAG-3; the underlined sequence corresponds to the primer target region) 및 805R (5-GTCTCGTGGGCTCGG -AGATGTGTATAAGAGACAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3) primers를 사용했다. DNA의 증폭과정은 초기 변성은 95℃에서 3분간 수행 후, 95 ℃에서 30초간 변성, 55 ℃에서 30초간 결합 및 72 ℃에서 30초간 증폭을 25회 반복하였고, 최종 증폭은 72 ℃에서 5분 동안 수행하였다. llumina Nex Terabarcode의 부착을위한 2차 증폭은 i5 정방향 primer (5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-XXXXXXXX-TCGTCGGCAGCGTC-3; X는 바코드 영역을 나타냄) 및 i7 역방향 primer (5-CAAGCAGAAGACTCGGCGAG
AT-XXXXXXXX –AGTCTCGTGGGCTCGG-3)로 수행하였다. 2차 증폭을 위한 조건은 1차 증폭과 동일하지만, 8개의 증폭 사이클을 사용하였다.
2차 증폭을 위한 조건은 1차 증폭과 동일하지만, 8개의 증폭 사이클을 사용하였다.
PCR 생성물은 2% agarose gel 전기영동을 사용하여 확인하였고 Gel Doc 시스템 (BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 시각화했습니다. 증폭된 생성물은 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)로 정제되었으며, 동일한 농도의 정제 된 생성물을 결합하고 짧은 단편(비 표적 생성물)을 Ampure bead kit(Agencourt Bioscience, Beverly, MA, USA)로 제거 하였다. 품질 및 제품 크기는 DNA 7500 chip이 있는 Bioanalyzer 2100 기기(Agilent, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 평가되었으며, 혼합 된 amplicons는 제조업체의 지침에 따라 Illumina MiSeq 시퀀싱 시스템(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 Chunlab, Inc.에서 풀링 및 시퀀싱되었다.
2.2.3 The MiSeq pipeline method
염기서열의 판독 처리는 Trimomatic 0.32 mutithreaded command line tool을 사용하여 품질확인 및 저품질(<Q25) 필터링을 실시하였다. 품질검사 통과 후, PandaSeq 알고리즘을 사용하여 양방향 염기서열데이터가 병합되었다. Primer는 (주)천랩의 CLcommunity 프로그램으로 유사도 0.8로 컷팅되었다.
염기서열은 염기서열 병합 및 고유 염기서열을 추출하는 Mothur 프로그램을 사용하여 노이즈를 제거하였고, 서열간 최대 2가지 차이점을 허용하였다. EzTaxon 데이터베이스는 BLAST 2.2.224를 사용하여 분류학적 분석에 사용되었고, Pairwise Alignment 프로그램을 사용하여 유사성을 계산하였다. Uchime과 EzTaxon의 nonchimeric 16S rRNA 데이터베이스는 97% 이하의 유사도를 가진 chimera 추출에 사용되었다. 그 다음, CD-HIT 7 및 UCLUST8 프로그램을 사용하여 염기서열데이터를 clustering하고 alpha diversity 및 종 분석을 수행하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 pH
전체 운전기간 (R1-R3) 동안의 pH의 변화를 Fig 3-1에 나타내었다. AD 반응조의 경우 R1의 start-up 단계에서 pH의 저하현상이 발생되었으며, 적정 운전조건을 회복시켜주기 위해서 Na2CO3 0.1M의 용액의 주입을 통하여 alkalinity를 보충해주었다[Park et al., 2018]. 약 100일 이후 pH가 안정화 되어 R2까지 유지되었지만, OLR 6.0 kg/m3・d인 R3에서 다시 pH가 6.0이하까지 저하되었다. 이때 추가적으로 주입된 alkalinity는 pH의 재안정화에 영향을 미치지 못하였으며, 순간적으로 증가된 pH는 빠른 속도로 재감소 되었다. 반면, BEAD 반응조의 경우 start-up 단계부터 pH의 저하현상이 나타나지 않았고, R1-R3 동안 pH는 각각 7.70 ±0.29, 8.04 ±0.17, 8.31 ±0.10로 안정적인 범위에서 유지되었다. 이는 BEAD 반응조가 운전초기 빠른 안정화와 높은 OLR에서 안정적인 pH의 유지가 가능하다는 것을 나타낸다[Song et al., 2016]. 음식물류폐기물의 고부하 혐기성소화는 빈번한 VFAs의 축적과 낮은 pH로 인하여 운전의 안정성을 확보하기 쉽지 않아 안정적인 처리효율을 기대하기 힘들다[Kiran et al., 2014]. 특히, 단일 혐기성소화조에서는 산생성과 메탄생성 단계의 불균형 정도가 매우 크기 때문에 음식물류폐기물의 고부하 운전에는 적합하지 않았다[Capson-Tojo et al., 2018]. 하지만, BEAD 반응조는 10.0 kg/m3・d의 OLR에서도 안정적인 pH와 alkalinity가 유지되면서 고농도 음식물류폐기물의 고부하 운전이 가능하다는 것을 나타냈다[Park et al., 2018; Hirano and Matsumoto, 2018]. 즉, BEAD 반응조에 공급된 미량의 전압은 음식물류폐기물의 산생성/메탄생성의 불균형을 해소할 수 있으며, 고부하에서도 운전의 안정성을 확보할 수 있는 기술임을 확인할 수 있었다.
Figure 3-1. Changes of pH in AD and BEAD reactors during the operation time.
3.2 VFAs
VFAs의 농도는 AD 및 BEAD 반응조의 가수분해 및 발효의 정도를 파악할 수 있는 좋은 정보를 제공하고, VFAs의 축적은 microorganism 대사의 저해인자로 작용하기 때문에 반응조의 효율을 평가할 수 있는 매우 지표로 사용된다[Wang et al., 2014; Jin et al., 2016]. 전체 운전기간 (R1-R3) 동안 AD와 BEAD 반응조의 volatile fatty acids (VFAs)의 농도를 Table 3-1에 나타내었다. AD 반응조에서는 운전초기 VFAs의 농도가 7,394 ±1,152 mg/L까지 축적되었으며, 이는 운전초기 낮은 유기물 제거효율을 나타내며, 반응조 내 VFAs가 축적됨으로서 pH 및 alkalinity 저하의 원인이 되었고, 이는 메탄발생에 저해인자로 작용하였다[Cavinato et al., 2017]. 특히, 안정화 후 R2까지 VFAs의 축적현상은 나타나지 않았지만, R3에서 다시 VFAs 축적현상 (최대 7,915 mg/L)이 재발생 되었다. 즉, AD 반응조에서는 음식물류폐기물의 산생성 속도가 빨라지면서 축적된 유기산이 메탄생성단계에서 메탄으로 빠르게 환원되지 못하였음을 의미한다[Zhang et al., 2014]. 반면, BEAD 반응조에서는 bio-electrochemical reaction에 의해서 VFAs가 빠르게 분해되면서 축적현상이 나타나지 않았고, R1-R3에서 VFAs의 농도는 각각 2,566 ±964, 3,083 ±234, 3,874 ±232 mg/L이었다. 전체 운전기간 동안 OLR이 증가함에 따라 BEAD 반응조에서의 VFAs의 농도가 증가하였지만, 급격한 축적현상은 나타나지 않았으며, 이는 메탄생성에 적합한 pH 및 alkalinity를 유지시킴으로서 빠른 안정화와 메탄발생이 가능하였음을 나타낸다. 즉, BEAD 반응조에서는 전기화학적 반응을 통한 유기산의 분해와 메탄 환원이 가속화되었고, 고농도 음식물류폐기물의 고부하 운전에서도 산생성과 메탄생성 단계의 균형을 유지시켜 VFAs의 축적의 저해인자를 빠르게 해소할 수 있음을 나타낸다.
Table 3-1. VFAs (AA, PA, and BA) concentrations of AD and BEAD reactors during operation time
3.3 박테리아 군집 분석
3.3.1 R1(2kg-COD/m3・day)
사전 연구를 통하여 R1에서의 박테리아 군집은 AD와 BEAD 모두 Clostridia와 Bacteroidia calss 순서로 우점하는 것을 확인했으며, Clostridia와 Bacteroidia class는 AD 반응조에서 각각 49.3%, 38.2%이었고, BEAD 반응조에서는 각각 56.6, 28.0 %이었다[Lee et al., 2017].
3.3.2 R2(4kg-COD/m3・day)
R2에서의 AD 및 BEAD 반응조 bulk solution 내의 박테리아 군집 분석결과를 Fig 3-2에 나타내었다. AD 반응조의 경우 Defluviitoga tunisiensis sp.가 45.3 %로 가장 높은 분포를 차지하였고, FN436026_s sp.와 HQ183800_s sp.가 각각 10.5, 5.6 %로 존재하였다. Defluviitoga tunisiensis sp.는 중온 또는 고온 혐기성소화에서 주로 탄수화물의 발효를 통하여 Acetate 또는 H2와 CO2를 생산할 수 있는 종으로 알려져 있다[Hnia et al., 2015; Maus et al., 2015]. FN436026_s sp.는 Porphyromonadaceae family로서 중온혐기성소화 반응조 내에서 당의 가수분해 및 산생성을 통하여 성장하는 박테리아로 알려져 있으며, HQ183800_s sp.는 Syntrophaceticus genus에 속하고 중온혐기성소화조에서 Acetate를 산화시켜 H2와 CO2를 생산하는 acetate-oxidizing bacteria로, 이들은 H2-utilizing methanogens와 공생관계를 통하여 성장한다[Jabari et al., 2012; Hahnke et al., 2015; Westerholm et al., 2010]. 즉, AD 반응조 R2 (4.0 kg/m3・d)에서는 음식물류폐기물에 다량으로 분포된 탄수화물 및 당을 H2와 CO2로 분해함으로써 반응조 내 VFAs의 축적을 방지하였고, 이는 R2에서의 안정적인 pH 및 alkalinity의 유지에 기여하였다.
BEAD 반응조의 경우 FN436068_s sp.가 약 38.7 %로 우점하였으며, GQ138794_s sp., Thermacetoge- nium_f_uc_s sp.가 각각 13.3과 10.1 %로 나타났다. FN436068_s sp.는 Bacteroidia class로서 다양한 BEAD 연구의 산화전극 및 bulk solution에서 우점하는 exoelectrogenic bacteria로 알려져 있으며, 이들은 다양한 VFAs를 Acetate 및 H2와 CO2로 산화시킬 수 있는 종으로 알려져 있다[Sarkar et al., 2016; Kong et al., 2018]]. GQ138794_s sp.는 Erysipelotrichaceae family에 속하며, glucose나 기타 다양한 탄수화물을 저분자의 유기산 또는 H2로 산화시킬 수 있는 박테리아로 알려져 있다[Verbarg et al., 2004]. Thermacetogenium_f_uc_s sp.는 Clostridia class로서 이들 역시 Bacteroidia class와 함께 대표적인 exoelectrogenic bacteria로 알려져 있으며, 다양한 유기물 및 VFAs를 산화시킬 수 있다[Deng et al., 2017].
정리해보면, AD 반응조에서는 탄수화물 및 당의 분해를 통하여 성장하는 bacteria의 비율이 높게 나타났고, BEAD 반응조에서는 다양한 BEAD 연구에서 보고된 exoelectrogenic bacteria의 비율이 높게 나타남과 동시에 탄수화물의 분해를 통하여 성장하는 박테리아의 군집 역시 높게 나타났다. 즉, R2에서는 AD와 BEAD 반응조에 각각 다른 종의 박테리아가 우점함으로서 안정적인 운전에 기여하였으며, 특히, BEAD 반응조에 공급된 전압은 exoelectrogenic bacteria의 군집구조 향상에 영향을 미쳤다.
Figure 3-2. Results of Bacterial communities analysis
in a AD (a) and BEAD (b) reactors at the end of R2 (4.0 kg/m3・d)
3.3.3 R3(6kg-COD/m3・day)
R3 AD 및 BEAD 반응조 bulk solution 내 microorganism communities를 분석한 결과를 Fig 3-3에 나타내었다. R3 (OLR: 6 kg/m3・d)에서 COD 제거와 메탄 발생량이 저하된 후 (운전 시작 후 657일) AD 반응조 bulk에서는 약 2,000 여종의 다양한 bacteria의 군집이 분석이 되었으며, Nitrospira defluvii sp.와 Ttrichococcus flocculiformis sp.가 각각 2.9와 2.5%로 우점하였다. De vrieze et al. (2014)은 높은 VFAs와 TAN(total ammonium nitrogen)의 농도가 높은 AD 반응조에서 Nitrospira와 Trichococcus의 군집구조가 높아진다고 보고하였으며, 이는 높은 OLR (R3, 6.0 kg/m3・d)에서 축적된 VFAs와 저하된 pH에 의해 bacteria의 성장환경이 파괴되면서 기질에 분포되어 있던 다양한 잡균들이 번식한 것으로 판단된다.
BEAD 반응조에서는 FN436026_s sp.가 약 19.3%로 우점 하였으며, GQ138794_s sp., Keratinibaculum_uc sp., and JF417900_s sp.가 각각 10.5, 6.8, and 6.6 %로 나타났다. FN436026_s sp.는 bacteroidia class로 다양한 BEAD 연구에서 exoelectrogenic bacteria로 알려진 종이다[Maus et al., 2015; Vanwonterghem et al., 2014]. GQ138794_s sp.는 R2 (13.3%)에 비하여 그 비율이 다소 감소하였지만, R2에서와 동일하게 두 번째로 우점하는 종이였다. GQ138794_s sp.는 Erysipelotrichaceae family로서 그 역할은 앞에서 설명한 바와 동일하다. Keratinibaculum_uc sp.와 JF417900_s sp.는 모두 Keratinibaculum genus에 속하는 종으로 이들은 30-65℃와 pH 6.0-10.5의 혐기성 조건에서 AA, PA, BA, isoBA, isovaleric acid 등 다양한 유기산을 에너지원으로 활용하여 성장하는 VFAs-oxidizing bacteria로 알려져 있다[Huang et al., 2013]. 흥미로운 사실은 Keratinibaculum genus에 속하는 종의 bacteria 군집구조가 약 21.6 %로 R2 (< 1.0%)에 비하여 크게 증가하였다는 것인데, 이는 OLR이 높아짐에 따라 반응조 내 축적되기 쉬운 유기산을 분해할 수 있는 bacteria의 분포가 높아짐으로서 pH 및 alklinity의 저하가 발생하지 않았고, 이는 안정적인 메탄발생량에 기인하였다는 것을 의미한다. 또한, 분석된 bacteria 중 Bacteroidia class와 Clostridia class는 각각 약 27, 6.8%로 R2 (약 46, 13.5%)에 비하여 다소 감소하였으나, exoelectrogenic bacteria의 우점은 동일하였다.
즉, 외부에서 공급된 전압은 BEAD 반응조 bulk solution 내의 exoelectrogenic bacteria와 VFAs-oxidizing bacteria의 군집구조를 향상시킴으로서 높은 OLR에서 반응조 내 축적되기 쉬운 VFAs의 빠른 분해가 가능하였다.
Figure 3-3. Results of Bacterial communities analysis
in a AD (a) and BEAD (b) reactors at the end of R3 (6.0 kg/m3・d)
4. 결론
BEAD 반응조는 6.0 kg/m3・d에서도 COD 제거율 및 메탄발생량이 안정적으로 유지되었지만, AD 반응조는 4.0 kg/m3・d가 적정 운전을 위한 최대 OLR이었다. 특히, 분해가 쉬운 음식물류폐기물의 고부하 혐기성소화시 문제가 되는 pH 및 alkalinity의 저하와 VFAs의 축적이 6.0 kg/m3・d에서 AD 반응조의 적정 운전조건을 파괴시키는 주요 요인이었으며, BEAD 반응조에서는 전기화학적으로 활성화된 Exoelectrogenic bacteria와 VFAs-oxidizing bacteria의 높은 군집구조가 VFAs의 축적을 방지할 수 있었다. 이는 pH 및 alkalinity를 적정 조건으로 유지시켜 안정적인 메탄발생에 기여한다.
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